Utilizzo del Microscopio  (ottico)

VISIONARE questo documento che descrive i  vari tipi di microscopi: ottico e/o in campo oscuro, ecc.

Il microscopio, come tutti gli strumenti dove interagiscono contemporaneamente tante variabili, può fornire immagini molto diverse dello stesso oggetto. Bisogna quindi avere sempre presente tutte le variabili in gioco e fare delle prove modificando:

1 - il diaframma del condensatore.

2 - la luminosità della sorgente.

3 - l'illuminazione specie in campo oscuro.

4 - la colorazione del preparato, se possibile. 

Il condensatore di solito deve stare molto vicino al vetrino; gli obiettivi devono essere periodicamente puliti esternamente con un pannetto bagnato nell'aceto che scioglie il calcare lasciato dalle gocce d'acqua sulla lente frontale.

Il computer puo’ essere collegato al microscopio; un semplice apparecchio per visualizzare le immagini del microscopio sul monitor di un computer è costituito da una WebCam (meglio se con sensore CCD, es. Logitek, perchè i colori sono più realistici di quelle con sensore CMOS).

A volte occorre e’ meglio togliere l'obiettivo della WebCam e l'oculare per avere un'immagine piu' nitida, anche se molto ingrandita, ma l'ideale è piazzare la WebCam davanti all'oculare e mettere a fuoco l'immagine ruotando l'obiettivo della stessa WebCam. 
Le immagini possono così essere catturate, salvate e stampate. 
Risultati sicuramente migliori si ottengono con una macchina fotografica digitale al posto della WebCam, ma l'uso è più complesso.
vedi: Diagnosi precoce del Cancro al microscopio

Il mezzo ottico più diffuso è, senza dubbio, il microscopio a campo chiuso.
Una fonte luminosa artificiale o naturale illumina il vetrino con il preparato da osservare, che appare più scuro rispetto allo sfondo. Il microscopio a campo chiaro permette l’osservazione a secco e ad immersione. Nel primo caso la luce raggiunge il preparato dopo aver attraversato l’aria; nel secondo caso, la luce attraversa una goccia di olio di cedro precedentemente depositata sulla superficie da osservare.
Gli obiettivi ad immersione consentono ingrandimenti massimi di 1.000-2.000 volte e sono ampiamente utilizzati in microbiologia, poiché forniscono un maggior ingrandimento e un’immagine più nitida, in quanto l’olio da immersione rende omogeneo il percorso del raggio luminoso fra il preparato e l’obbiettivo del microscopio. Al microscopio ottico si può collegare il computer per ricavare immagini digitali, più nitide e precise.
Nel microscopio a campo oscuro la luce è riflessa dal preparato e non dal vetrino, di modo che i microrganismi appaiono luminosi in un campo nero.
Le cellule viventi prive di pigmenti non sono chiaramente visibili al microscopio in campo chiaro per la scarsa differenza di contrasto esistente tra le cellule e l’acqua (Fig. 15a). Il microscopio in campo oscuro si ottiene collocando un diaframma per campo oscuro sotto il sistema delle lenti del condensatore di un microscopio ottico. In questo modo si crea un cono di luce cavo che colpisce l’oggetto e solo la luce riflessa e rifratta proveniente dal campione formerà l’immagine.
Così le cellule del campione appariranno chiare su uno sfondo scuro. Tale tecnica permette di migliorare le differenze di contrasto tra le cellule e il mezzo circostante evitando di usare l’uso di colorazioni.

Il microscopio a contrasto di fase utilizza i cambiamenti di fase della luce quando incontra il preparato da osservare; poiché i cambiamenti sono estremamente piccoli, si montano filtri adatti per accentuare le differenze, insieme a specchi che, opportunamente disposti, danno un’immagine tridimensionale.
Benché sia possibile analizzare “a fresco” le cellule, nella gran parte dei casi il materiale da osservare al microscopio ottico deve essere colorato per evidenziare le sue caratteristiche, l’esame “a fresco” è fatto direttamente su cellule vive senza trattamenti con coloranti; non consente l’uso di obiettivi ad immersione, pertanto non permette forti ingrandimenti, ma è utile per osservare l’eventuale movimento dei microrganismi. È un esame valido soprattutto per l’osservazione di microrganismi di maggiori dimensioni (funghi e protozoi), meno per gli altri microrganismi.
Le colorazioni vengono applicate per lo più su cellule morte, anche se talvolta si ricorre a coloranti vitali.
Le colorazioni di uso più comune in batteriologia sono la Gram, la Ziehl-Neelsen, la Neisser-Gins e quella con il blu di metilene.
 

La microscopia in campo scuro fornisce immagini veramente belle e suggestive, inoltre risulta particolarmente utile nella osservazione di batteri altrimenti quasi invisibili in campo chiaro, diatomee e insetti. Lo speciale condensatore ha lo scopo di dare al preparato un'illuminazione radente lasciando buia la parte inquadrata dall'obiettivo. Per capire il funzionamento farò un piccolo esempio. Immaginiamo una superficie nera come quella di un tavolo laccato e supponiamo che sia leggermente impolverata.. Se la osserviamo in luce ambiente essa sembrerà pulita ma se la osserviamo quando il sole la illumina obliquamente ci accorgeremo della polvere che come per magia risplenderà come di luce propria.   Qui a fianco è schematizzato il percorso della luce nella microscopia in campo scuro utilizzando l'apposito condensatore. Risultati abbastanza soddisfacenti si ottengono anche illuminando lateralmente il vetrino con una lampadina o interponendo prima del condensatore per campo chiaro dischi di cartoncino nero al centro dello stesso. Al fine di compiere buone osservazioni è necessario compiere queste operazioni: - centrare il condensatore  - regolare l'apertura del diaframma di campo in relazione all'obiettivo usato  - regolare adeguatamente l'altezza del condensatore  - utilizzare una lampada di forte intensità luminosa. Inizialmente questa sequenza potrebbe risultare difficile e noiosa ma con la pratica tutto risulterà semplice e automatico.

La microscopia in "Campo Oscuro" è una metodologia di studio delle cellule del sangue vivo per mezzo di un microscopio con un particolare condensatore.
I condensatori che sono utilizzati nella microscopia in campo scuro sono di due tipi:
- tipo parabolico (ha una superficie a specchio)
- tipo cardioide con due superfici a specchio.
L'uso di uno o l'altro è poco preciso, di una di esse, la luce non ha alcun impatto diretto sul bersaglio (questo è lo scopo di questi condensatori), ma si concentra con una apertura maggiore del target.
L’obiettivo riceve la luce diffusa o riflessa dalle strutture del campione da analizzare. Per raggiungere questo scopo, il microscopio a campo scuro e’ dotato di uno speciale condensatore che illumina il campione con una forte luce indiretta.
Di conseguenza, nel campo visivo si osserva un fondo scuro dietro il campione su cui compaiono piccole particelle luminose del campione per riflettere po 'di luce verso l’obiettivo.
Questa forma di illuminazione viene utilizzata per analizzare gli elementi biologici e non pigmentati trasparenti, invisibili alla luce normale e senza fissare il campione, cioè viene osservato in vivo.

Le immagini ottenute, possono essere utilizzate in un videoproiettore ed registrate in un computer.
 

Questo metodo è uno strumento principalmente utilizzato dai medici che seguono le medicine complementari. Si tratta di un' analisi del sangue vitale.
Fornisce importanti informazioni sull' "ambiente interno" dell'organismo, il quale si rispecchia nella funzione delle cellule ematiche.
Si osservano il potenziale sviluppo di piccole strutture (dette: protiti oppure endobionti) in strutture più complesse (batteri oppure stadi precedenti ai funghi).
La microscopia in campo oscuro rivela dei cambiamenti della funzionalità delle cellule sanguigne, come pure delle deposizioni di fibrina (proteiche) che spesso per tanto tempo precedono una patologia e sono più frequentemente da vedere in situazioni di patologica alcalosi del sangue - il metodo serve allora come mezzo di prevenzione come pure di controllo delle terapie eseguite.
Non sostituisce il convenzionale "quadro ematologico", ma lo completa, visto che quello e una enumerazione dei corpuscoli presenti nel sangue -senza però dire nulla sulla funzione di essi.
Sotto la ripetuta osservazione durante alcune ore si possono vedere le più o meno rapide alterazioni del sangue, il cambio della vitalità, della resistenza dei globuli rossi e bianchi e trombociti, oppure la crescita di strutture batteriche - un fenomeno, altrimenti non visibile.
Spesso si trovano così delle indicazione per la presenza di problemi intestinali, linfatici o derivanti da focolai (tonsille, denti ecc.); altrettanto, debolezze del sistema immunitario oppure la tendenza verso un' allergia possono essere visualizzate.
Come si effettua l'esame
Si prende una piccola goccia di sangue da un dito o dal lobo dell' orecchio con un ago molto fine. La goccia viene subito posta su un vetrino portaoggetti, senza fissazione o colorazione. Dopo, il campione è messo sotto il microscopio in campo oscuro e osservato ad un ingrandimento di ca. 1300 volte. Il paziente può seguire l'analisi su uno schermo.
Il primo esame dura ca. 10 - 15 minuti, il medico, però deve valutare lo sviluppo dopo 1 ora, 4-6 ore e ancora più tardi.

Sotto il profilo medico diagnostico, sempre maggiore importanza ha assunto la microscopia in campo oscuro, elaborata da Enderlein, in grado di visualizzare la presenza di organismi pleomorfi su campioni di sangue umano fresco.
La microscopia in campo oscuro permette una visione morfologica molto significativa.
La forma, la dimensione il comportamento delle cellule del sangue possono essere indicative per lo studio dinamico della biologia dell’organismo.

L’esame del sangue vivo, utilizzando questa speciale tecnologia richiede una pratica costante negli anni.

Questa tecnica microscopica ci potrà fornire le seguenti informazioni:
- controllo delle dimensioni e forma degli eritrociti ossigenazione delle emazia

- determinare la presenza di microrganismi simbionti o parassiti secondo gli insegnamenti del dott. G.Enderlein.
- integrità delle membrane delle cellule sanguigne ed eventuali parassiti che vi si insediano
- mobilità dei granulociti
- resistenza vitale del sangue
- presenza di tossine metaboliche
- presenza di muffe o funghi
- stati infiammatori acuti e cronici
vedi anche: http://www.camposcuro.it/analisi-sangue-vivo.php

La microscopia a "Contrasto di Fase" serve per l'analisi di una goccia secca di sangue; il test è denominato "Bolen-Heitan est" e fornisce le seguenti informazioni:

- età biologica - vedi anche Bioelettronica  +  Nozione di Terreno

 - danni da radicali liberi

- terreno infiammatorio

- tendenze a malattie croniche

Il referto viene correlato di foto a colori dei particolari più significativi.

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Microscopio a luce polarizzata
La scoperta dei cristalli liquidi è stata resa possibile da uno speciale microscopio costruito dal fisico tedesco Otto Lehmann, scienziato che Friedrich Reinitzer aveva coinvolto nello studio dei fenomeni osservati riscaldando il benzoato di colesterile.
Oltre a uno strumento che permetteva di variare la temperatura del campione, questo microscopio era anche dotato di un dispositivo in grado di filtrare la luce attraverso due filtri polarizzatori.

Quando si fa passare la luce naturale attraverso un filtro polarizzatore, questo seleziona le onde in base al piano della loro vibrazione. La luce che ne risulta, pur rimanendo composta di onde che vibrano su varie frequenze, vibra solo su uno degli infiniti piani su cui vibra la luce naturale. Ricordiamo che la luce naturale, infatti, non solo oscilla sulle diverse frequenze che corrispondono ai colori dello spettro della luce dall'ultravioletto all'infrarosso, ma queste oscillazioni avvengono su tutti i piani perpendicolari alla direzione della propagazione della luce. Il primo dei due filtri polarizzatori è sistemato tra la sorgente di luce e il campione contenente i cristalli. Il secondo, detto analizzatore, sta invece tra il campione e l'osservatore.

I due polarizzatori sono orientati l'uno rispetto all'altro, in modo che, se il primo lascia passare solo le oscillazioni verticali, il secondo, ruotato di 90° rispetto al primo, lascia passare solo le oscillazioni orizzontali.
La luce verrebbe di conseguenza interamente oscurata, se i reticoli cristallini, che costituiscono il tipico oggetto di osservazione con questo microscopio, non fossero otticamente attivi e non ruotassero di un certo angolo il piano di polarizzazione della luce. In questo modo, la luce non viene interamente bloccata dal secondo filtro, il quale permette piuttosto di analizzare la particolare modificazione a cui la luce è stata sottoposta dal cristallo.
La maggior parte dei cristalli presentano infatti il fenomeno della birifrangenza, sono cioè in grado di scindere la luce polarizzata in due radiazioni che oscillano, a diversa frequenza, l'una su di un piano ortogonale rispetto al piano su cui oscilla l'altra.
Il filtro analizzatore viene così raggiunto dalla luce che ha attraversato il cristallo e che non è completamente sprovvista dalla componente orizzontale, perché ha subito una ulteriore polarizzazione. Questa luce risulta anche colorata, perché un raggio ha una frequenza diversa dall'altro e le frequenze dell'uno interferiscono con quelle dell'altro.
L'osservazione al microscopio a luce polarizzata prevede la rotazione del supporto su cui giace il cristallo, che quindi appare accendersi e spegnersi nei suoi diversi colori di interferenza a seconda della sua orientazione. Dall'analisi di queste variazioni si possono quindi ricavare preziose informazioni sulla struttura del reticolo molecolare che forma ciascuno dei cristalli inquadrati.
Le immagini sono state realizzate con un microscopio a luce polarizzata presso la Liquid Crystal Institute's Facility for Materials and Surface Characterization.
http://ulisse.sissa.it/biblioteca/saggio/2005/Ubib050401s003
http://www.lci.kent.edu/lc.html  +  http://micro.magnet.fsu.edu/moviegallery/chemicalcrystals/liquidcrystals/index.html

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Da una ricerca del Centro S3 del CNR-INFM - Un microscopio a scansione per "vedere" in campi magnetici
Nella fase sperimentale, il dispositivo ha consentito di registrare per la prima volta i campi magnetici e al contempo il profilo topografico di uno strato di nanomagneti

Osservare campi magnetici debolissimi sulle superfici dei materiali: è questo l’obiettivo scientifico di un nuovo microscopio a scansione realizzato da un gruppo di ricercatori del Centro S3 dell'INFM-CNR e dell’Università di Modena.
Secondo quanto viene riferito nel resoconto pubblicato sulla rivista online “Small”, L’innovativo strumento è stato realizzato combinando un microscopio a scansione con un sensore magnetico estremamente sensibile.
L’analisi della superficie di un campione avviene grazie allo sfioramento di una punta costituita da pochi atomi in grado di rilevare corrugamenti con dimensioni dell’ordine del nanometro, a cui è associato un sensore che può rivelare campi magnetici con una risoluzione spaziale di alcuni milionesimi di metro.

Nella fase sperimentale, il dispositivo ha consentito di registrare per la prima volta i campi magnetici e al contempo il profilo topografico di uno strato di nanomagneti.
Questi ultimi sono strutture molecolari di dimensioni tipiche di alcuni nanometri che si candidano a costituire i bit - ovvero i mattoni logici elementari - per la realizzazione di memorie ad alta densità dei futuri computer.
“Questo strumento ci ha permesso di misurare in maniera diretta le proprietà dei nanomagneti molecolari sulle superfici anche a temperature molto basse, fino a -270 gradi e, più in generale, ci aiuta a capire la magnetizzazione alla scala molecolare”, ha commentato Marco Affronte, che ha messo a punto il dispositivo con Alberto Ghirri, Andrea Candini, Marco Evangelisti e Gian Carlo Gazzadi. “Si pensi alla memoria di un disco rigido costituita da una superficie magnetizzata: essere in grado di controllare la magnetizzazione su scala molecolare permetterà di realizzare memorie a densità molto più elevata di quella attuale”. (fc)
Tratto da: lescienze.espresso.repubblica.it

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MICROSCOPIO - Due scatti per i nano-magneti
Un nuovo strumento permette di misurare, contemporaneamente, il campo magnetico e la struttura atomica della materia su scala nanometrica. Implicazioni per le future generazioni di memorie ad alta densità

Istantanee di microscopici e debolissimi campi magnetici, generati da molecole di appena qualche nanometro (miliardesimi di metro). Le hanno ottenute i ricercatori del Centro S3 dell’Istituto Nazionale per la Fisica della Materia (Infm-Cnr) di Modena e dell’Università di Modena e Reggio Emilia, grazie a un nuovo strumento, presentato oggi in un articolo sulla rivista Small.
Si tratta di un microscopio a scansione combinato a un nuovo sensore magnetico estremamente sensibile. Il microscopio a scansione sfiora con la sua punta - costituita da pochi atomi - la superficie del campione da analizzare e ne rileva le rugosità con una risoluzione di alcuni nanometri. Accanto alla punta, il sensore magnetico registra l'intensità del campo, anche se con un dettaglio inferiore (di milionesimi di metro).
In questo modo i ricercatori sono riusciti a ottenere contemporaneamente, per la prima volta, le immagini della struttura atomica e le proprietà magnetiche di un sottilissimo strato di nano-magneti su un supporto di silicio.
“Il microscopio ci permette di misurare in maniera diretta le proprietà dei nano-magneti molecolari su superficie, anche a temperature prossime allo zero assoluto, fino a meno 270 gradi”, spiega  Marco Affronte che, insieme a Alberto Ghirri, Andrea Candini, Marco Evangelisti e Gian Carlo Gazzadi, ha messo a  punto lo strumento. “Soprattutto”, continua il ricercatore, “ci aiuta a comprendere la magnetizzazione alla scala molecolare”.
Implicazioni importanti si prospettano nel campo dell'informatica: controllare la magnetizzazione su scala molecolare permetterà, infatti, di realizzare memorie a densità molto più elevata di quella attuale, cioè più piccole e più capienti. I nano-magneti molecolari  potrebbero essere i bit nei computer del futuro. (t.m.)
Tratto da: galileonet.it

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Il superlaser a raggi X che riesce a vedere nella cellula viva - 03/02/2012 
Funziona come un potentissimo microscopio - In un altro esperimento scaldato un plasma a 2 milioni di gradi - In un altro esperimento scaldato un plasma a 2 milioni di gradi.
Milano (I) - Si potrà scrutare all’interno di una molecola biologica viva e in azione, ma anche nel cuore di un atomo. La straordinaria possibilità, che offrirà vantaggi notevoli alla ricerca biologica e medica, è una delle possibili applicazioni del primo laser a raggi X che i ricercatori americani dello Slac National Accelerator Laboratory sono riusciti a costruire e a far funzionare.
45 ANNI DOPO
La strada è stata lunga e ardua perché questo tipo di strumento era ipotizzato già nel 1967, ma è occorso quasi mezzo secolo per passare dalla teoria alla pratica. Lo strumento – sottolineano gli scienziati – permetterà di arrivare a scoperte prima impossibili.
Il nuovo laser descritto sulla rivista britannica Nature funziona come un potentissimo microscopio. Bombardando con un fascio laser una capsula di neon, prima si spingono gli elettroni degli atomi a livelli superiori provocando poi un crollo degli stessi a livelli inferiori. Ciò causa un’emissione di fotoni nel campo dei raggi X a una lunghezza d’onda brevissima innescando all’interno dell’atomo di neon la generazione di altri raggi X con un effetto domino che amplifica la luce laser di duecento milioni di volte.

RAGGI X
Finora non si era riusciti in questa impresa perché non esisteva una sorgente di raggi X abbastanza potente da riuscire a innescare l’emissione del laser, i cui impulsi brevissimi riescono a «illuminare» l’interno di una molecola biologica viva senza distruggerla e quindi vedere cose prima mai viste.
Nel laboratorio americano del Department of Energy (Doe) il bombardamento degli atomi di neon avviene con il Linac Coherent Light Sources, oggi la più potente sorgente X esistente al mondo.
Alla realizzazione ha contribuito anche un gruppo di ricercatori tedeschi della Max Planck Society di Amburgo.

LASER e FUSIONE  
È curioso notare che, contemporaneamente, in una stanza vicina degli stessi laboratori californiani Slac, un altro gruppo di ricercatori è riuscito a ottenere un interessante risultato nel campo legato alla fusione nucleare e sempre con laser a raggi X.
Partendo ancora dal potentissimo Linac hanno bombardato un campione di alluminio creando un plasma con una temperatura di due milioni di gradi Celsius. Il tutto è durato un trilionesimo di secondo.
Questo genere di esperimenti viene condotto per studiare le caratteristiche del plasma al fine di governarlo per produrre energia, come si dovrà fare nei futuri reattori a fusione. Gli scienziati americani per gestire il plasma fanno ricorso ai raggi X mentre nella macchina Iter in costruzione a Cadarache, in Francia, si sperimenta il confinamento magnetico.
By Giovanni Caprara - Tratto da: corriere.it

Il super laser a raggi X
A Menlo Park, in California, c'è il più potente laser a raggi X del mondo, chiamato Linac Coherent Light Source (LCLS).
Qualsiasi atomo, molecola o granello di polvere posto al centro del suo sottilissimo fascio raggiunge nel giro di pochissimi femtosecondi  una temperatura superiore a un milione di Kelvin, alla quale un atomo viene privato di tutti i gusci elettronici che ne proteggono il nucleo. 

Alimentato da uno dei più importanti acceleratori lineari di particelle, lo SLAC, questo laser è una meravigliosa apparecchiatura ricca di innovazioni tecnologiche, che permette lo studio della materia in condizioni insolite. Come descrivono Nora Berrah e Philip H. Bucksbaum nell'articolo Il laser a raggi X più potente del mondo, pubblicato sul numero di marzo di “Le Scienze”, il fascio uscente può infatti creare stati esotici della materia, e ottenere immagini di atomi e molecole, chiarendo i meccanismi che sottostanno alle reazioni chimico-fisiche che governano la materia.
Con le sue animazioni 3D, il video ci accompagna all'interno dello SLAC mostrando come l'energia delle particelle accelerate viene poi trasformata in fasci di radiazione X coerente, e illustrandone gli effetti quando centra un bersaglio
(Cortesia SLAC National Accelerator Laboratory)

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vedi anche: Medicina Quantistica
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